胚胎干细胞诱导分化机制和方法

  【Abstract】  Embryonic stem cell is a kind of undifferentiated pluripotent stem cell, which stems from preimplantation ICM or early fetus primordial germ cell. The research about differentiation of embryonic stem cell has been a hotspot in medical field now, but the mechanism of differentiation and the  directional differentiation have not known very well. Recently, there are dramatic developments in these fields, this paper elaborated the mechanisms differentiation on induced differentiation of embryonic stem cells, methods on induced differentiation of embryonic stem cells, questions  on induced differentiation of embryonic stem cells.

    【Key words】  embryonic stem cell; induced differentiation; mechanism; method

    自1981年英国的Evans等从小鼠囊胚的内细胞团（Inner cell mass，ICM）分离建立胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES细胞）以来，ES细胞的研究就一直是各国研究的热点。近两年，ES细胞分化诱导以及调控方面的研究取得了很多重要的进展，已从ES细胞诱导出神经细胞、心肌细胞、血管和内皮细胞等。利用ES细胞的定向分化可望在基因研究、细胞治疗和组织器官替代治疗等的研究中发挥重要作用。

　　1  ES细胞定向分化的调节机制

    自1988年发现了白血病抑制因子能抑制ES细胞分化后，人们就开始研究其定向分化，通过将外源基因转入ES细胞研究其表达及微环境对细胞分化的影响，认为ES细胞的分化受内源性因素和外源性因素的共同调节。分化机制如下。

    1.1  内源性影响因素  内源性因素即不同基因在不同时间和空间的开启和关闭及各种转录因子等。从分子水平来看，ES细胞分化的本质问题是基因表达调控。

    1.1.1  基因的不同表达水平  有些基因如Oct-4基因和Nanog基因等在体内通过不同的表达水平来调控ES细胞的分化。

    1.1.2  基因的差异表达  在个体发育中，基因按照一定程序，有选择地相继活化的现象称为基因的差异表达。在胚胎发育过程中所以能相继分化出各种新类型细胞，就是由于相关基因相继活化而合成特异蛋白质的结果。Cross等［1］研究证明细胞定型时是通过强化某些基因的表达并抑制另一些基因的表达来形成某个单一谱系所特有的基因表达型。如缺乏干细胞白血病转录因子的ES细胞不能分化为血细胞和内皮细胞共同的前体细胞。    1.1.2.1  通过Oct-4基因的不同表达水平调控ES细胞分化  Oct-4基因是ES细胞的一个特异标志分子。Oct-4是一种调节性基因，它的职责是控制其他基因的表达。无论是在体内还是体外，Oct-4基因只在全能或多能性细胞如ES细胞和EG细胞中表达。Oct-4基因的敲除使小鼠胚胎不能形成ICM，而完全由滋养外胚层组成，并在植入时死亡。RNA干扰实验显示Oct-4表达下调引起ES细胞分化，形成滋养层或内胚层，说明Oct-4基因在维持胚胎细胞的发育全能性和ES细胞不分化状态的调节中起着重要的作用。Niwa等［2］研究发现，Oct-4不同的表达水平指导ES细胞的3种不同命运，即Oct-4表达上调2倍使ES细胞分化为原始内胚层细胞，Oct-4表达下调使ES细胞分化为滋养层细胞，Oct-4表达水平不变才能使ES细胞维持不分化状态。因此，Oct-4被视为多能细胞发动、维持及分化的主要候选调控因子。

    1.1.2.2  Nanog基因维持ES细胞的不分化状态  近年来在确定维持ES细胞不分化状态相关基因方面最大进展也许是Nanog基因的发现［3］。Nanog基因仅在ES细胞中特异表达，在分化的ES细胞和体细胞中不表达；Nanog基因缺陷的ES细胞失去多能性，开始分化；导入了Nanog基因的ES细胞株在LIF拮抗剂存在时仍能保持30%的不分化ES细胞。Nanog在桑葚胚等全能胚胎中不表达，仅在囊胚期的ICM中表达，之后限制在晚期囊胚的外胚层表达，胚胎植入后Nanog的表达迅速降低。体内实验还表明Nanog基因缺陷的胚胎仅包括一些不能辨认的胚外组织，而没有外胚层或胚外外胚层。这些结果提示Nanog是Oct-4基因启动后维持内细胞团全能性所必需的。Nanog的作用机制目前尚不清楚。Nanog基因只在ES细胞中发挥作用，在其他干细胞中则处于休眠状态，如果能够找出某种方法激活该基因，成体干细胞也许就能再次成为ES细胞。

    1.1.3拯救因子和免疫“豁免”特权  研究人员发现ES细胞能够分泌出特殊的“拯救因子”来逆转小鼠的致死性的先天缺陷。尽管很少有干细胞真正长成健康的心脏组织，但研究人员发现干细胞能够分泌出特殊的分子，这些分子能发出信号给临近的心脏细胞从而修复先天缺陷器官的功能。另一个研究成果表明人类ES细胞具有独特的免疫“豁免”特权。实验证实在小鼠活体内移植的未分化人类ES细胞不会引起移植排斥的特定免疫反应，这项研究对人类ES细胞移植治疗具有重要意义   

1.1.4  。  奢侈基因  某些基因对细胞自身生存并无直接影响，不是必需的，但却决定着细胞向特殊类型分化的物质基础。如编码肌细胞肌球蛋白的基因，编码结缔组织的胶原蛋白的基因等。Michael等［4］利用心肌细胞-肌球蛋白重链的启动子转染ES细胞，